植物凝集素刺激外周血单个核细胞增殖及分泌因子表达的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3707-3714.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.017

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植物凝集素刺激外周血单个核细胞增殖及分泌因子表达的变化

王鼎，宋兵，钟旋，孙筱放，范勇

广东省产科重大疾病重点实验室，广东省高校生殖与遗传重点实验室，广州医科大学附属第三医院，广东省广州市 510150

修回日期:2014-04-02 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 范勇，博士，副主任技师，硕士生导师，广东省产科重大疾病重点实验室，广东省广州市 510150
作者简介:王鼎，男，1984年生，山东省泰安市人，汉族，2011年中山大学中山医学院毕业，博士，助理研究员，主要从事干细胞与组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81202604，31171229，U1132005)；广东省自然科学基金资助项目(S2013040 012649)；广东教育基金资助项目(2013KJCX0149)；广州市科信局计划(2011y-00038-1)；教育部博士点新教师项目(B2012169)

Phytohaemagglutinin stimulates the proliferation of peripheral blood mononuclear cells and expression of secretory cytokines

Wang Ding, Song Bing, Zhong Xuan, Sun Xiao-fang, Fan Yong

Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Key Laboratory of Reproduction and Hereditary of the Universities in Guangdong Province, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Revised:2014-04-02 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Fan Yong, M.D., Associate chief technician, Master’s supervisor, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Key Laboratory of Reproduction and Hereditary of the Universities in Guangdong Province, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Wang Ding, M.D., Assistant researcher, Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province, Key Laboratory of Reproduction and Hereditary of the Universities in Guangdong Province, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81202604, 31171229, U1132005; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013040012649; the Educational Foundation of Guangdong Province, No. 2013KJCX0149; the Plan of Science and Information Technology Bureau of Guangzhou City, No. 2011y-00038-1; the Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China, No. B2012169

摘要/Abstract

摘要：

背景：植物凝集素可以刺激外周血单个核细胞分裂并引起免疫细胞的活化，是常用的细胞增殖模型。但是全血中的非外周血单个核细胞成分(血浆和无核细胞)在植物凝集素参与的体外培养过程中起到什么作用，以及内皮分泌因子的表达情况尚不明确。

目的：在体外单独培养或全血培养外周血单个核细胞过程中，观察植物凝集素对其增殖和凋亡的影响，以及相关炎症因子以及内皮分泌因子的表达变化。

方法：分离正常核型成人的外周血单个核细胞，应用无植物凝集素培养基和加入植物凝集素培养基分别进行单独培养，观察细胞形态学变化。收集全血培养或不同条件单独培养的外周血单个核细胞，提取mRNA，荧光定量RT-PCR检测细胞增殖、凋亡，以及炎症因子和内皮分泌因子的表达变化，并进行统计学分析。

结果与结论：外周血单个核细胞单独培养和全血培养存在差异，植物凝集素会促进外周血单个核细胞 Ki67、增殖细胞核抗原、蛋白水解酶3、γ-干扰素、肿瘤坏死因子β和白细胞介素6的基因表达，抑制蛋白 C表达。提示植物凝集素促进体外培养外周血单个核细胞的增殖及凋亡，促使炎症因子表达上调，部分血液生物学相关的内皮分泌因子下调。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 植物凝集素, 外周血单个核细胞, 细胞因子, 细胞增殖, 细胞凋亡, 炎症因子, 内皮分泌因子, 全血培养, 体外培养, 荧光定量RT-PCR, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Phytohemagglutinin (PHA) can stimulate the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into cell cycle, and cause their immune activation, which is a common immune proliferation model. However, the role of non-PBMC ingredient of peripheral blood is unclear, as well as the expression of endothelial cells related cytokines.

OBJECTIVE: To study the effect of whole blood culture and PBMCs alone culture with PHA on the PBMC proliferation and apoptosis, expression of inflammatory cytokine and endothelial cell secreted cytokine markers.

METHODS: Morphological changes of PBMCs separated from normal karyotype human peripheral blood individually cultured with or without PHA were observed. The PBMCs were collected by whole blood culture or PBMC separated culture. mRNA was extracted for the fluorescence quantitative RT-PCR, which was applied to detect the cell proliferation, apoptosis, and expression of inflammatory cytokine and endothelial cell secreted cytokines. The statistic analysis was used for the significance explication.

RESULTS AND CONCLUSION: PBMCs alone cultured ere different from those undergoing whole blood culture. The PHA could up-regulate the gene expression of Ki67, proliferating cell nuclear antigen, Caspase 3, interferon-γ, tumor necrosis factor-β and interleukin-6, but down-regulate Protein C. This indicted that PHA could promote the proliferation and apoptosis of PBMCs and up-regulate the expression of inflammatory cytokines, but down-regulate the expression of endothelial cells secreted coagulation cytokines.

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Key words: stem cells, plant lectins, cytokines, cell proliferation, apoptosis

中图分类号:

R394.2

王鼎，宋兵，钟旋，孙筱放，范勇. 植物凝集素刺激外周血单个核细胞增殖及分泌因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3707-3714.

Wang Ding, Song Bing, Zhong Xuan, Sun Xiao-fang, Fan Yong . Phytohaemagglutinin stimulates the proliferation of peripheral blood mononuclear cells and expression of secretory cytokines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3707-3714.

图/表（结果） 4

2.1 不同方法分离外周血单个核细胞比较 见表2。

通过荧光定量反转录PCR比较通过淋巴细胞分离液所得外周血单个核细胞和裂解红细胞所得外周血单个核细胞在细胞增殖、凋亡以及分泌(凝血)细胞因子的表达量差异。

以淋巴细胞分离液所得外周血单个核细胞的各基因表达量为1，计算裂解红细胞所得外周血单个核细胞的基因表达量。统计学分析发现两者之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 外周血单个核细胞体外培养形态学观察 对淋巴细胞分离液分离的单个核细胞进行光镜观察发现细胞较小，细胞分散较好，没有细胞聚集现象。在无植物凝集素的培养基中培养60 h，仍有大量细胞分散，同时出现少量细胞克隆，克隆较小；在含植物凝集素的培养基中培养60 h，细胞形态相近，部分细胞悬浮于培养基中，有少量细胞克隆出现，细胞克隆明显大于无植物凝集素培养所现克隆，高倍光镜观察，发现部分克隆呈现红色(图1)。因全血培养，红细胞较多，无法光镜观察。

细胞遗传分析显示，3个样本均为正常核型。培养前分离外周血单个核细胞组和不加入植物凝集素培养组无分裂相，加入植物凝集素组可见分裂相。

2.3 植物凝集素促进外周血单个核细胞增殖以及凋亡检测细胞培养以及培养过程中添加植物凝集素，引起的外周血单个核细胞的Ki67、增殖细胞核抗原、MCMP和蛋白水解酶3基因表达的变化(表3)。

相对培养前的外周血单个核细胞：①在不添加植物凝集素组中，外周血单个核细胞培养组蛋白水解酶3的表达明显上调；全血培养组MCMP明显下降，蛋白水解酶3的表达明显上调(P < 0.05)。②在添加植物凝集素组中，外周血单个核细胞培养和全血培养组结果一致，Ki67、增殖细胞核抗原和蛋白水解酶3明显上调(P < 0.05)，MCMP变化不明显(P > 0.05)。相对不添加植物凝集素组，添加植物凝集素的培养中，外周血单个核细胞培养和全血培养组结果一致，Ki67、增殖细胞核抗原和蛋白水解酶3明显上调(P < 0.05)，MCMP变化不明显(P > 0.05)。相对外周血单个核细胞培养，全血培养中蛋白水解酶3明显下调(P < 0.05)，不添加植物凝集素组的Ki67和MCMP明显下调(P < 0.05)，其他基因表达变化不明显(P > 0.05)，见图2。

2.4 植物凝集素促进外周血单个核细胞免疫类细胞因子表达选取免疫调节中重要的分泌类细胞因子(γ-干扰素、肿瘤坏死因子β和白细胞介素6)进行荧光半定量测定，检测不同的体外培养和植物凝集素的加入对其基因表达的影响(表3)。

所有的免疫类分泌因子，植物凝集素加入组对比空白组和培养前外周血单个核细胞都有明显升高(P < 0.05)。全血培养组(不含植物凝集素)γ-干扰素表达量较培养前和外周血单个核细胞单独培养有明显下降(P < 0.05)。

肿瘤坏死因子β和白细胞介素6变化较一致：①全血培养组(不含植物凝集素)与培养前外周血单个核细胞比较变化不明显，单纯外周血单个核细胞培养组较两者有明显升高。②含植物凝集素的外周血单个核细胞单纯培养组较含植物凝集素的全血培养组表达量明显升高(图3)。

2.5 体外培养及植物凝集素对内皮类因子表达的影响因外周血中可以分离、培养内皮细胞，而内皮细胞是凝血的重要靶细胞。为检测体外培养和植物凝集素的加入对内皮细胞的影响，对内皮(或者凝血)类重要的分泌类细胞因子(血管内皮生长因子、促红细胞生成素和蛋白C)进行荧光半定量测定(表1)。

发现血管内皮生长因子和促红细胞生成素的表达量在加入植物凝集素培养后有所升高，血管内皮生长因子变化不明显(P > 0.05)，而促红细胞生成素变化差异有显著性意义。蛋白 C的表达在加入植物凝集素培养后有明显下降 (P < 0.05)，见图4。

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引言

植物凝集素是从植物中萃取的一种糖蛋白和蛋白质的混合物，因可引起红细胞凝集而得名。虽然不同种类植物凝集素中糖蛋白和蛋白质的混合比例不同，但是它们的生物学作用相近：①可以引起红细胞凝集。②作为分裂原(mitogen)，可以刺激外周血单个核细胞幼化和分裂。在临床医学中，基于血细胞培养的细胞遗传分析是将全血接种于含有植物凝集素的培养基中，以刺激外周血单个核细胞增殖，促进其进入细胞周期，然后加入秋水仙素使分裂相停滞在分裂中期，最后通过显带或探针杂交进行遗传学分析的^[1-2]。同时，针对外周血单个核细胞细胞增殖的研究中，通过植物凝集素活化分离培养的外周血单个核细胞，可以获得通用的细胞模型^[3-7]。细胞凋亡是与增殖相对应的生物学活动，植物凝集素在刺激外周血单个核细胞增殖的同时，是否会抑制细胞凋亡呢？目前尚未发现相关的研究。文章旨在比较全血培养和单独培养的外周血单个核细胞的增殖等指标是否存在差异。通过检测细胞凋亡重要指标蛋白水解酶3的表达量，探讨植物凝集素-外周血单个核细胞模型中的凋亡情况，评价植物凝集素对外周血单个核细胞的生物学效应。

外周血单个核细胞主要是淋巴细胞及少量的内皮细胞。植物凝集素刺激外周血单个核细胞的增殖同时也是免疫活化过程，该过程中淋巴细胞(主要是T细胞)免疫活动增强，免疫相关炎症因子如γ-干扰素、肿瘤坏死因子β、白细胞介素6、白细胞介素2等会升高，可作为研究药物免疫调节的重要模型^{[3-4, 8-11]}。植物凝集素的免疫调节作用已用于治疗因免疫功能受损而引起的疾病，如白血病、贫血、肝炎等^[12-15]；同时，经植物凝集素活化的免疫细胞也可以用于治疗此类疾病。文章比较两种不同培养方法对外周血单个核细胞分泌型炎症相关细胞因子表达的影响，可以评价建立细胞免疫模型方法的优劣，为不同的细胞模型应用提供参考。

外周血单个核细胞中含有少量内皮细胞，可通过特定的方法进行分离培养^[16-17]。植物凝集素主要刺激外周血单个核细胞系统中淋巴细胞的增殖，外周血单个核细胞中的内皮细胞的生物学活动是怎样的呢？文章通过检测内皮细胞生长相关因子血管内皮生长因子和促红细胞生成素，以及内皮凝血效应重要蛋白——蛋白C的表达情况，探讨不同体外培养方法以及植物凝集素对内皮细胞生长及生物学效应的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2013年6至12月在广州医科大学附属第三医院妇产科研究所(广东省产科重大疾病重点实验室与广东省高校生殖与遗传重点实验室)完成。

材料：

临床样本：随机选取3例30-40岁，因不孕不育进行染色体检查的无免疫疾病，染色体核型分析正常的健康人，男女不限，留取其经肝素钠抗凝的外周血。

外周血提供者对试验方案知情同意，且得到医院伦理委员会批准。

方法：

全血培养：将0.5 mL外周血300×g离心5 min，收集细胞沉淀加入红细胞裂解液，37 ℃孵育30 min，300×g离心 5 min收集细胞沉淀，得到全血培养组的培养前对照。另将0.5 mL外周血接种至装有5 mL外周血培养基(80%1640培养基+体积分数20%胎牛血清)的细胞培养瓶中，对照组不加植物凝集素，实验组加入植物凝集素(200 mg/L)。分别置于体积分数5%CO₂培养箱37 ℃培养60 h。将细胞悬液300×g离心5 min，收集细胞沉淀，加入红细胞裂解液， 37 ℃孵育30 min，再经300×g离心5 min，收集细胞沉淀，得到全血培养的外周血单个核细胞^[1-2,7]。

外周血单个核细胞分离与培养：将3 mL外周血用生理盐水1∶2稀释。稀释的血样缓慢加入至已分装淋巴细胞分离液的离心管中，800×g离心10 min，吸出分层中云雾状的单个核细胞层，生理盐水冲洗，300×g离心5 min，收集细胞沉淀。将得到的细胞平均分成3份，分别用于淋巴细胞培养组的培养前对照、接种至5 mL外周血培养基中、接种至含200 mg/L植物凝集素的外周血培养基中，并在光镜下观察拍照。将培养瓶置于体积分数5%CO₂培养箱，37 ℃培养60 h，光镜下观察拍照，收集悬液，300×g离心5 min，收集细胞沉淀^[18]。

细胞遗传分析：对部分直接分离的外周血单个核细胞和培养后的4组细胞进行细胞遗传分析。方法为0.4%KCl低渗破细胞膜，固定液(按照乙酸∶甲醇比例为1∶3配置)固定。滴片，60 ℃老化过夜，胰酶消化显带，吉姆萨染料染色，镜检。

荧光定量RT-PCR：在收集的单个核细胞中加入1 mL TRIzol，提取总RNA。RNA吸光度260 nm/280 nm大于1.8代表RNA纯度较高。电泳得到3条明显的条带，分别代表5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA，确定RNA较完整。将1 μg总RNA按反转录试剂盒说明书操作，反转录得到cDNA。按SYBR说明进行 PCR预实验，扩增内参18 s RNA，根据内参扩增的循环时间(Cycle time，Ct值)，调整cDNA稀释比例，保证实验组cDNA量相当。进行PCR实验时，每个样本进行3个重复，根据每个重复Ct值的差异判断实验的误差。ΔCt用实验组的平均Ct值减去对照组的平均Ct值得到，对照组的相对RNA量为1，实验组的相对RNA量为：稀释倍数×2^-^ΔCt。荧光定量RT-PCR检测蛋白水解酶 3、增殖细胞核抗原、Ki67、MCMP、γ-干扰素、肿瘤坏死因子β、白细胞介素6、血管内皮生长因子、促红细胞生成素、蛋白C的表达。PCR引物见表1。

主要观察指标：荧光定量RT-PCR检测细胞增殖、凋亡以及炎症因子和内皮分泌因子的表达变化。

统计学分析：对3个独立实验样本的每个检测指标，以相对对照组的RNA量x(_)±s表示，采用SPSS 19.0进行配对t检验统计学分析，表达量增加2倍以上或者减少一半，且 P < 0.05时认为差异有显著性意义。

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讨论

外周血单个核细胞主要是淋巴细胞，还有少量的内皮细胞^[19-20]，这些有核细胞都可以通过分离，进行体外扩增培养。体外细胞培养是一种生长环境可控的体系，可以为研究复杂的体内活动提供良好的模型，有利于研究细胞增殖、凋亡和其他生物学性状。外周血单个核细胞中免疫相关细胞的主要作用是调控机体免疫；而内皮细胞在刺激凝血等方面发挥作用，其来源可能是血管内皮脱落的细胞。

植物凝集素是单个核细胞的促细胞分裂原之一，可以促进单个核细胞的扩增^{[6, 21-22]}，这一特性已经被广泛应用于细胞遗传检验^[23-24]；另一方面，活化的外周血单个核细胞是研究免疫抑制的重要细胞模型^{[3, 25-27]}。但是，这一模型被普遍认为是免疫相关细胞的增殖模型，其实存在着诸多误区，如这一模型中的细胞凋亡、非免疫细胞(内皮细胞)的培养情况如何，均是干扰因素，对模型的应用可能存在影响。全血培养和外周血单个核细胞单独培养之间是否存在差异也不明确。

本文将完善对于植物凝集素刺激外周血单个核细胞模型的认识。Ki67、增殖细胞核抗原和MCMP是独立的细胞增殖信号通路的关键蛋白，而蛋白水解酶3是细胞凋亡信号通路的主要蛋白^[28]。

本文检测了Ki67、增殖细胞核抗原、MCMP和蛋白水解酶3的mRNA表达，探讨植物凝集素促进外周血单个核细胞增殖的方式，以及全血(包括血浆和红细胞)对外周血单个核细胞增殖的影响。结果提示植物凝集素促进外周血单个核细胞增殖主要是通过上调Ki67和增殖细胞核抗原进行的，MCMP的变化不明显；但是伴随增殖指标的上升，凋亡指标蛋白水解酶3也有明显的上调，提示植物凝集素引起细胞增殖并不是通过抑制细胞凋亡完成的。通过比较外周血单个核细胞的单独培养和全血培养发现，在全血培养过程中，植物凝集素的作用被抑制(即Ki67，MCMP和蛋白水解酶3的表达明显下调(P < 0.05)，增殖细胞核抗原的表达下调但变化不明显(P > 0.05)，推测可能是培养过程中保留自体血浆可以稳定单个核细胞培养环境，抑制植物凝集素的细胞学效应的原因。

植物凝集素可以促进外周血单个核细胞增殖^[29]，外周血单个核细胞大部分是免疫相关细胞，因此可能伴随着免疫细胞特异性表面标志和细胞因子的变化^{[6, 9, 21-22]}。γ-干扰素、肿瘤坏死因子β和白细胞介素6都是免疫调节类的分泌型细胞因子，在淋巴细胞(T、B细胞)活化过程中表达上调^{[4, 6, 30]}。

本文的体外培养实验中，加入植物凝集素会使外周血单个核细胞的γ-干扰素、肿瘤坏死因子β和白细胞介素6的mRNA表达上调。但是对比全血培养和外周血单个核细胞单独培养的实验，发现肿瘤坏死因子β和白细胞介素6变化一致，全血培养组的表达会较外周血单个核细胞组明显下调 (P < 0.05)；而γ-干扰素的表达会上调(P > 0.05)，两者变化不一致。这一结果提示在外周血单个核细胞的体外培养过程中，全血的存在对不同免疫细胞活化信号通路会产生影响，作用效果不一致。

外周血中会残留少量的内皮细胞(或者内皮祖细胞)，这些细胞可以体外分离培养^[16-17]。血管内皮生长因子、促红细胞生成素和蛋白 C是内皮细胞相关的细胞因子，其中，血管内皮生长因子和促红细胞生成素是由内皮细胞(或者内皮祖细胞)分泌，可促进其自身增殖和分化^[31-32]；而蛋白C由成熟内皮细胞分泌，在抗凝过程中发挥重要作用(促使纤维蛋白溶解)^[33]。在半定量RT-PCR时，发现这3个基因的表达量很低，需要加倍模板才能有明显扩增。相对培养前，各培养组的血管内皮生长因子和促红细胞生成素表达都有所升高，血管内皮生长因子变化不显著，而促红细胞生成素变化显著。这一结果提示外周血单个核细胞中可能含有表达血管内皮生长因子和促红细胞生成素的细胞，体外培养过程中这些细胞增殖。蛋白C在体外培养过程中下降，而加入植物凝集素后，其下降差异有显著性意义，推测可能因为成熟内皮细胞凋亡或者其特定的生物学活性降低。

本文比较了体外外周血单个核细胞单独培养和全血培养的过程中，外周血单个核细胞细胞增殖、凋亡、炎症因子和内皮分泌的因子的表达变化，以及植物凝集素在这一过程中的作用。研究发现植物凝集素促进外周血单个核细胞增殖的同时引起凋亡，促进炎症因子表达上调，部分内皮功能相关细胞因子上调，凝血因子下调，自体血液相关物质(全血)对这一过程可能有影响。研究结果可为进一步研究外周血单个核细胞的体外活化和植物凝集素的血液生物学作用提供参考。

植物凝集素刺激外周血单个核细胞增殖及分泌因子表达的变化

Phytohaemagglutinin stimulates the proliferation of peripheral blood mononuclear cells and expression of secretory cytokines

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